PRÁCTICA MÓDULO ECOTOXICOLOGÍA: CÁLCULO DE LAS CONCENTRACIONES LETALES 50 (CL50) A 96 HORAS PARA LA TOXICIDAD DEL NITRITO EN DOS ESPECIES DE INVERTEBRADOS DE AGUA DULCE (Eulimnogammarus toletanus y Polycelis felina)


Fecha: 11 y 13 de febrero de 2014
Biología, Universidad de Alcalá
Profesor: Álvaro Alonso Fernández (Dpto. Ecología)
Lugar: Aula El Viso (Facultad de CC.AA)

1. Objetivo de la Práctica


El objetivo de la práctica es calcular las CL50 (concentración letal 50) (o LC50) a 96 horas de un tóxico en dos especies de invertebrados acuáticos y poder comparar la sensibilidad a ese tóxico entre ambas especies. Para ello se realizará una regresión lineal entre la concentración de tóxico (variable independiente) y la respuesta de una población (mortalidad=variable dependiente). La técnica estadística a emplear será una regresión de tipo Probit.

La tarea a realizar se detalla en negrita AL FINAL DEL TEXTO, pero antes hay que hacer una pequeña explicación y ver los datos que vamos a emplear para los cálculos:

2. ¿Qué es la Regresión Probit y qué utilidad tienen en Ecotoxicología?


La regresión Probit consiste en un tipo particular de regresión lineal que se construye con el objetivo de conocer la relación que existe entre una variable independiente (la concentración de tóxico) y una variable dependiente (la respuesta=mortalidad) para una especie y una exposición determinada (normalmente 48 o 96 horas). Para ello la respuesta acumulada de los organismos (mortalidad acumulada) se transforma a unidades probit (eje Y) y la concentración de tóxico se transforma logarítmicamente (eje X). El resultado es una recta en la cual podemos interpolar el 50% de la respuesta y conocer que concentración de tóxico causa esa respuesta (CL50). La CL50 (para un tiempo dado, normalmente 48 o 96 horas) es la concentración letal 50, es decir la concentración de tóxico necesaria para causar la muerte del 50% de la población de estudio en un tiempo determinado (la DL50 sería la dosis letal 50, y se utiliza cuando conocemos la cantidad de tóxico que hay en el interior del organismo).

La CL50 (o CE50 cuando el parámetro que se estudia es diferente a la mortalidad) es útil en ecotoxicología para:

  • Comparar sensibilidades entre diferentes especies para un mismo tóxico.
  • Comparar toxicidad de varios compuestos para una misma especie.
  • Determinar criterios de calidad.
  • Es un parámetro que se suele utilizar para exposiciones cortas (=agudas o a corto plazo), y por tanto suele emplear concentraciones relativamente altas de tóxico.

Para calcular la CL50 es necesario realizar una regresión concentración-respuesta. Si se representa la mortalidad acumulada en % (en el eje Y) y la concentración en el eje X (log-ln trasformado) de los datos lo que obtenemos es una respuesta de tipo sigmoidal:







Dosis-Respuesta_con_ln_con.JPG
Fig. 1. Concentración-Respuesta






El objetivo principal de la transformación probit es hacer lineal la relación entre dosis-respuesta. La transformación probit procede de la Normal Equivalent Deviation (NED), que es la proporción de mortalidad expresada en unidades de desviación estándard de la media de una curva normal. Se suele sumar 5 a la NED para evitar valores negativos. La respuesta de nuestra población se debe ajustar a una distribución normal del tipo:



Dosis-Respuesta_distribución_normal.JPG
Fig. 2. Distribución normal





Si transformamos el eje Y en unidades Probit (50% es 0, 84% es 1, 16% es -1, etc.) y el eje X en logaritmo lo que obtenemos es una recta del tipo (fijaros que el eje Y se encuentra en escala probit pero no en unidades probit):




Dosis-Respuesta_transformado.jpg
Fig. 3. Concentración-Respuesta con transformación Probit y logarítmica



Probit.png
Relación entre la mortalidad y la concentración. Fijaros como a tiempos más cortos hacen falta concentraciones más elevadas


Debido a que el modelo de regresión siempre tiene asociado un grado de incertidumbre, el valor de CL50 tiene asociado unos límites de confianza, que normalmente se expresan al 95%, es decir hay un 95% de probabilidades que nuestro valor de CL50 se encuentre dentro de ese intervalo. De tal manera que la CL50 para una especie concreta se expresa de la forma:

CL50 96 horas = X (X1-X2)

Siendo X el valor de CL50 predicho por el modelo y X1 y X2 el límite inferior y superior, respectivamente. Si tenemos dos valores de CL50 con sus límites para dos especies podemos testar estadísticamente que especie es más sensible a un tóxico concreto. Para ello, si los límites de confianza entre las dos especies no salapan se puede afirmar que una de las especies es más sensible que la otra con una p de 0.05 (es decir hay un 5% de probabilidades que esa afirmación sea incorrecta). En ecotoxicología la CL50 nos informa de la sensibilidad de la especie a un compuesto concreto, lo cual nos puede ayudar a determinar criterios de calidad (límites máximos de contaminante que pueden estar presentes en el ecosistema). Un método para determinar un criterio de calidad es basarse en la especie más sensible del ecosistema, por lo tanto el resto de especies no se verán afectadas si se respeta ese límite. También, si en un proceso industrial tenemos la posibilidad de utilizar dos compuestos químicos para una misma función podemos utilizar aquel compuesto que presenta una más baja toxicidad (en base a valores de CL50). La primera vez que se empleó la regresión probit fue en la década de los 30 para determinar que concentración de pesticida era eficaz para terminar con plagas de insectos que atacaban a cultivos (Bliss CI. (1934) The method of probits. Science 79 2037: 38–39), a partir de entonces es uno de los métodos más utilizados para el cálculo de la CL50 (=LC50) (LD50=DL50).

3. Cálculo de las CL50 a 96 horas y sus límites de confianza para dos especies de macroinvertebrados bentónicos: Eulimnogammarus toletanus y Polycelis felina

DSCF2097.JPG
Fig. 4. Pocillos experimentales


Las dos especies son de agua dulce. La primera es una anfípodo y la segunda es una planaria (Turbellaria). Para cada especie se situaron 10 individuos en pocillos de 100 ml de volumen (Fig 4) y se emplearon 5 concentraciones crecientes de nitrito (NO2-) y un control (sin nitrito), para cada especies y tratamiento se emplearon tres pocillos (=tres réplicas por tratamiento). La Fig. 5. muestra un esquema del diseño experimental de los bioensayos.

Dosis-Respuesta_diseño_experimental.JPG
Fig. 5. Diseño experimental

Cada día se renovaron las soluciones de tóxico y del agua de los controles para evitar la oxidación del nitrito a nitrato y para evitar la acumulación de desechos procedentes de los animales (es un bioensayo estático con renovación diaria).

Tras 96 horas se cuantificó la mortalidad en cada una de las réplicas (=pocillos), contando el número de organismos muertos. Los resultados obtenidos fueron (PF=Polycelis felina, ET=Eulimnogammarus toletanus):

Concentración PF
(mg N-NO2/l)
Respuesta PF
(nº total)
Total
Concentración ET
(mg N-NO2/l)
Respuesta ET
(nº total)
Total
30
2
10
0.5
0
10
30
1
10
0.5
1
10
30
4
10
0.5
2
10
50
5
10
1.0
2
10
50
6
10
1.0
2
10
50
3
10
1.0
0
10
100
7
10
2.0
5
10
100
8
10
2.0
8
10
100
5
10
2.0
3
10
150
8
10
3.0
7
10
150
7
10
3.0
9
10
150
7
10
3.0
6
10
200
9
10
4.0
9
10
200
10
10
4.0
10
10
200
8
10
4.0
8
10

Utilizando el programa estadístico STATGRAPHICS calcula las CL50 a 96 horas para las dos especies con sus respectivos límites de confianza. Para ello sigue las instrucciones que te da el profesor.



TRABAJO A REALIZAR:

  • Crea un fichero WORD (guardar con formato .doc) con el nombre PRACT-LC50-GRUPO Nº
  • Incluye en el fichero WORD una Tabla (creada por medio de Word) con los resultados para la CL50 (y sus límites de confianza al 95%). Pensar en como hacerla, te recomiendo utilizar un papel y hacer un borrador de la Tabla antes de poneros a trabajar en el ordenador.
  • Incluye un texto (encabezado de la tabla) explicando lo que muestra la tabla (debe permitir a cualquier lector entender su contenido). Algunos ejemplos de artículos científicos que contienen tablas: EJEMPLO1, EJEMPLO2
  • Incluye los resultados del test estadístico de solapamiento entre las dos CL50 en la Tabla ¿cómo lo harías para que por medio de un único símbolo pudieramos saber si son diferentes estadísticamente o no?
  • Envia el fichero 5 minutos antes del final de la práctica a: alvaro.alonso@uah.es





















































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